KHẢ NĂNG KHÁNG Vibrio spp. VÀ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA Lactobacillus farciminis HN12

Trịnh Thị Phương Thảo và CS. Tập 131, Số 2A, 2022 92 nuôi cấy, mật độ tế bào được điều chỉnh đến giá trị 108 tế bào/mL và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 °C để loại bỏ tế bào. 50 μL dung dịch sau ly tâm được cho vào từng giếng trên đĩa thạch đã chứa vi khuẩn chỉ thị. Mẫu được ủ ở 4 °C trong 15 phút đến khi dung dịch trong giếng khuếch tán đều. Sau đó, đĩa được tiếp tục ủ ở 30 °C trong 24 giờ và kiểm tra đường kính vòng vô khuẩn (zone diameter of inhibition – ZDI) xuất hiện trên bề mặt đĩa. Hoạt tính kháng khuẩn được tính theo công thức: AU/mL = (ZDI × 1000)/V. Trong đó: ZDI là đường kính vòng vô khuẩn (mm) và V là thể tích dịch nuôi cấy sau khi ly tâm của vi khuẩn lactic (μL). 2.3 Định danh phân tử DNA của chủng vi khuẩn được tách chiết theo phương pháp của Sambrook và cs. DNA tổng số được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% ở điện thế 80 V trong 55 phút. Gel được quan sát dưới đèn tử ngoại [12]. Sau khi kiểm tra chất lượng bằng điện di trên gel agarose 0,8%, DNA tổng số được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng cặp mồi 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5’ GGTTACCTTGTTACGACTT- 3). Thành phần PCR bao gồm 6 μL master mix, 10 pmol mỗi primer, 50 ng genomic DNA và nước cất vừa đủ 12 μL. Sau khi được biến tính ở 95 °C trong 5 phút, chu trình nhiệt PCR bao gồm các bước biến tính 95 °C trong 1 phút, bắt cặp 55 °C trong 1 phút, kéo dài 72 °C trong 1 phút 30 giây, lặp lại 30 chu kỳ. Sau đó, phản ứng PCR được thực hiện ở 72 °C trong 10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di agarose gel 0,8%.

Sản phẩm PCR gen 16S rRNA được giải trình tự nucleotide tại công ty Firstbase (Malaysia) theo phương pháp Sanger bằng máy giải trình tự gen Applied Biosystems® Genetic Analyzers. Các trình tự nucleotide được phân tích bằng phần mềm Bioedit (Version 7.2.6.1) và trình tự nucleotide hoàn chỉnh được so sánh dữ liệu nucleotide của NCBI (National Center for Biotechnology Information). Cây phát sinh loài được xây dựng sử dụng phần mềm MEGA 11 với hệ số boostrap 1000 lần lặp lại [13]. 2.4 Khả năng chịu mặn Khuẩn lạc vi khuẩn từ môi trường MRS agar trên đĩa Petri được cấy chuyền vào MRS lỏng và tiến hành nuôi cấy ở 37 °C trong 24 giờ. Sinh khối sau khi nuôi cấy được thu nhận bằng cách ly tâm ở 5.000 vòng/phút ở 4 °C trong 5 phút. Sinh khối được tiếp tục tái huyền phù trong nước muối sinh lý và điều chỉnh để OD600 nm = 1. Sau đó, tiến hành phân phối vào mỗi Eppendorf 100 μL huyền phù và 900 μL môi trường MRS bổ sung thêm NaCl ở các nồng độ 5, 10, 15 và 20% (w/v). Đo OD600 nm tại các thời điểm 0 giờ và 48 giờ ủ ở 37 °C [14].